Protocole de Western Blot (WB) – Recommandé par les utilisateurs d’anticorps Tebubio

Protocole WB & conseils techniques – améliorez la reproductibilité de vos résultats

Forts de leur propre expérience et de celle de nos utilisateurs d’anticorps tebu-bio, nos spécialistes anticorps vous proposent ce protocole Western Blot.

Un tutoriel conçu par les scientifiques, pour les scientifiques – des étapes précises, utilisant des anticorps et des produits associés provenant de sources connues, validées et traçables, vous permettent d’assurer un niveau élevé de fiabilité et de reproductibilité de vos expériences, en accord avec les exigences de publication.

Avec nos remerciements à Dr Mark Livingstone pour la préparation de ce protocole.

Etape n°1 – Les réactifs requis pour votre SDS-PAGE et WB

Les solutions doivent être préparées avec de l’eau ultra pure déionisée ou un équivalent.

• Tris-HCl (1.5M, pH 8.8): Mélanger 91g de Tris base (23483-100) avec de l’eau distillée dans un volume total de 400mL. Ajuster le pH à 8.8 à l’aide du NaOH puis , ajouter de l’eau distillée pour obtenir un volume final de 500mL.

• 10% APS (Ammonium Persulfate): Dissoudre 1g d’APS (1708-0100) dans de l’eau distillée pour un volume total de 10mL. Aliquoter dans des tubes de 1,5mL et stocker à -20°C.

• Tris-HCl (0.5M, pH 6.8): Mélanger 30g de Tris base (23483-100) dans de l’eau distillée pour un volume total de 400mL. Ajuster le pH à 6.8 à l’aide du NaOH puis, ajouter l’eau distillée pour obtenir un volume final de 500mL.

• Tampon DS contenant du DTT 2X (1mL): Ajouter 50uL de DTT à 1M récemment préparé ou décongelé dans 1mL de tampon SDS 2X (MB-018).

• Tampon de migration SDS-PAGE 1X (1L): Mélanger 900mL d’eau distillée, 100mL de tampon Tris-Glycine 10X (24088-500), et 10mL de SDS 10% (MB-015).

• Tampon de transfert SDS-PAGE 1X (1L): Mélanger 700mL d’eau distillée, 100mL de tampon Tris-Glycine 10X (24088-500), et 200mL d’éthanol (100%).

Pour les grosses protéines, certains protocoles recommandent de réduire la proportion en éthanol à 10% ou d’ajouter du SDS (<0.05%).

• PBST 1X (Phosphate Buffered Saline avec 0.1% de Tween 20): Ajouter 1mL de Tween 20 (T20) & 1L de PBS 1X.

• Tampon de saturation (100mL): Mélanger 85mL d’eau distillée, 10mL de PBS/NaN3 10X (MB-011), 5g de lait écrémé en poudre (1602-0250), 100uL de Tween 20 (T20), bien mélanger. Stocker à 4°C.

• Tampon de dilution pour anticorps primaire (100mL): Mélanger 85mL d’eau distillée, 10mL de PBS/NaN3 10X (MB- 011), 5g de BSA (1501-0100) et bien mélanger. Stocker à 4°C.

• Tampon de dilution pour anticorps secondaire (100mL): Dissoudre 5g de lait écrémé WB-grade en poudre (875014-200G), dans 95mL de PBST 1X et bien mélanger. Stocker à 4°C.

• Anticorps secondaire: Selon les espèces utilisées pour produire l’anticorps primaire:
  • Lapin – 611-1322 (2 mg)
  • Souris – 610-1302 (2mg)
  • Chèvre – 605-4302 (2 mg)

Ces anticorps sont fournis en solution. Lorsque vous achetez des anticorps lyphilisés, resuspendez les anticorps dans une solution tampon 1X pour le stockage des anticorps secondaires (pour 10mL, mélanger 4,5 mL d’eau distillée, 100uL de HEPES (MB-062-0100), 300ul de NaCl à 5M (MB-047), 20mg de BSA (1501-0100), et 5mL de glycerol. Stocker les aliquots à – 20°C.

Etape n° 2 – Préparation des échantillons – Cellules de mammifères adhérentes cultivées dans une plaque de 10cm

1. Retirer le milieu de culture et laver les cellules 2 fois avec du PBS 1X, aspirer ce qui reste du tampon.
2. Ajouter le tampon de lyse RIPA 1X (MB-030-0050) (250 µl) à chaque plaque 10cm. Gratter immédiatement les cellules pour les décoller de la plaque et transférer ce qui a été récolté dans un tube pour microcentrifuger. Garder les cellules dans la glace. Soniquer pendant 10 à 15 secondes à l’aide d’une sonde sonicatrice pour couper l’ADN.
   Alternativement, les lysats peuvent être microcentrifugés à la vitesse maximale à 4°C et le surnageant peut être collecté, cependant certaines protéines liées à l’ADN peuvent être perdues).
3. Quantifier la quantité totale de protéines dans le lysat en utilisant le kit Total Protein Determination Kit (M1585), en respectant les instructions du fournisseur.
4. Mélanger 20ul de Tampon SDS 2X, 20ug de protéines totales (volume basé sur le kit), et une quantité suffisante de tampon de lyse RIPA 1X pour obtenir un volume total de 40ul.
5. Chauffer l’échantillon à 95–100°C pendant 5 min, microcentrifuger brièvement, et stocker à -20°C jusqu’à la prochaine utilisation.

Etape n° 3 – SDS-PAGE et transfert sur Membrane de Nitrocellulose

6. Préparer un mini gel de séparation SDS-PAGE (10mL):

Dans un tube en plastique de 15mL, mélanger une solution d’acrylamide/bisacrylamide et d’eau distillée avec les volumes indiqués dans le Tableau 1, selon le poids moléculaire de la protéine étudiée. Ajouter 2,5mL de Tris-HCl (1.5M, pH 8.8), 100ul de SDS à 10% (MB- 015), 80uL de APS à 10%, et 4uL de TEMED (1718- 0030). Bien mélanger la solution et pipetter immédiatement entre les deux plaques (plastique ou verre) comme indiqué par le manuel du fournisseur SDS-PAGE. Remplir la chambre jusqu’à atteindre un niveau qui soit 1cm en dessous du bas du peigne du gel lorsqu’il sera mis à la prochaine étape. Recouvrez le gel avec de l’éthanol à 100%. Après que le gel de séparation ait polymérisé (environ 15 minutes), vider l’éthanol.
Tableau 1 – Volumes de solution d’acrylamide/bisacrylamide et d’eau distillée requis pour faire un gel de polyacrylamide.

Tableau 1 – Volumes de solution d’acrylamide/bisacrylamide et d’eau distillée requis pour faire un gel de polyacrylamide.

* Pour des résultats optimaux, utiliser acryl./bisacryl. 37.5:1 (24165-100) pour des gels 12% et 15% et utiliser acryl./bisacryl. 29:1 (24169-100) pour des gels 10% et 7.5% gels.

7. Préparer un mini gel de concentration SDS-PAGE : Dans un tube plastique de 15mL, mélanger 500uL d’acryl./bisacryl. 29:1 (24169-100), 2,2mL d’eau distillée, 940uL de Tris-HCl (0.5M, pH 6.8), 38uL de SDS à 10% (MB-015), 38uL d’APS à 10%, et 4uL de TEMED (1718-0030). Bien mélanger la solution et pipetter immédiatement au-dessus du gel de séparation. Ajouter le peigne.
8. Après que le gel de concentration ait complètement polymérisé, retirer le peigne. Charger le gel de polyacrylamide dans l’appareil à gel SDS-PAGE comme indiqué par le fourniseur et pré-remplir les chambres ainsi que les puits du gel avec du tampon de migration SDS-PAGE 1X.
9. Mettre 5ul de Multicolor Protein Marker (TM0005) dans la première ligne du mini gel SDS-PAGE à l’aide d’une pipette..
10. Chauffer les lysats cellulaires de l’étape 5 à température ambiante, centrifuger brièvement, et charger 20-30 ul d’échantillon par puits.
11. Démarrer la migration jusqu’à ce que le marqueur atteigne le bas du gel.
12. Préparer le transfert en utilisant un système de buvard à réservoir humide:

Laver l’appareil de transfert et les éponges avec de l’eau juste avant usage.
Ajouter du tampon de transfert SDS-PAGE 1X au réservoir contenant les éponges. A l’aide de ciseaux, couper les membranes de transfert en nitrocellulose et du papier buvard Whatman un peu plus large que le gel SDS-PAGE. Tremper les membranes de nitrocellulose et le papier buvard dans du tampon de transfert SDS-PAGE 1X. Démonter le gel SDS-PAGE, et préparer des tas dans la cassette de transfert selon l’ordre suivant: partie blanche de la cassette/éponge/papier buvard/membrane de nitrocellulose/gel/papier buvard/éponge/partie noire de la cassette.Une pipette de 10mL devrait être utilisée pour enlever les bulles après que le dernier papier buvard soit mis sur le tas.
Fermer et mettre la cassette dans l’appareil de transfert en faisant attention à la polarité positive (blanc/rouge) et négative (noir).

13. Ajouter une tige magnétique au réservoir, fermer le couvercle et effectuer le transfert à 4°C en remuant. Un courant continu de 300mA pendant 2 heures est généralement conseillé.
14. Une fois le transfert terminé, déplacer la membrane de nitrocellulose sur une plaque en verre ou en plastique.

Note: une boîte de cônes est utile pour ce genre de manipulation.

Optionnel: Protocole de marquage au rouge Ponceau. Preparer la solution de marquage au rouge Ponceau, en mélangeant 10mL d’eau distillée, 0,3mL d’acide acétique froid, 33mg de rouge Ponceau, bien mélanger puis ajouter une quantité suffisante d’eau distillée pour obtenir un volume final de 30mL. Laver la membrane de nitrocellulose deux fois avec de l’eau distillée puis marquer la membrane de nitrocellulose avec la solution de marquage au rouge Ponceau pendant 5 minutes avec une agitation douce. Retirer la solution de marquage au rouge ponceau et laver la membrane avec de l’eau distillée au moins trois fois et visualiser les protéines cellulaires.

A ce stade, il est possible d’évaluer sur la membrane si la quantité de protéine mise dans chaque puits est similaire. Il peut être utile de prendre une photo ou scanner la membrane marquée ou de couper la membrane horizontalement afin d’utiliser un anticorps primaire sur la partie supérieure de la membrane et un autre sur la partie inférieure.

15. Laver la membrane avec du PBST 1X.

Etape n° 4 – Saturation, Incubations d’anticorps, et détection

16. Incuber la membrane dans 10mL de tampon de saturation pendant une heure à température ambiante avec une agitation douce.
17. Laver la membrane avec du PBST 1X.
18. Incuber la membrane dans 10mL de tampon de dilution d’anticorps primaire en présence de l’anticorps primaire à la dilution appropriée (e.g. 10uL pour une dilution à 1:1000), pendant toute la nuit à 4°C avec une agitation douce, ou pendant une heure à température ambiante.
19. Collecter l’anticorps dilué et le garder pour des utilisations ultérieures à 4°C. WB detection protocol tebu-bio
20. Laver la membrane trois fois avec 10mL de PBST.

21. Incuber la membrane dans 10mL de tampon de dilution d’anticorps secondaire en présence de l’anticorps secondaire à la dilution appropriée (e.g. HRP anti-lapin si un anticorps primaire de lapin a été utilisé), pendant une heure à température ambiante.
22. Eliminer l’anticorps secondaire et le tampon utilisés et laver la membrane de nitrocellulose 3 à 5 fois avec du PBST pendant 5 minutes à chaque fois, avec une agitation douce.
    Note: a ce stade, d’autres lavages supplémentaires avec une agitation plus forte améliorent souvent la ratio signal/bruit de fond du Western Blot.
23. Preparer le substrat de l’ECL (Enhanced Chemiuminescence) (10mL): Mélanger 5mL de chacun des réactifs A et B (SL100309).
24. Suite au dernier lavage en PBST, éliminer le PBST et incuber la membrane dans 10mL de substrat de l’ECL pendant une minute avec une agitation douce.
25. Prendre la membrane avec des pinces, toucher le coin avec du papier absorbant et placer la membrane entre 2 feuilles de plastique transparent (par exemple: transparents pour projecteurs, film saran, un sac plastique fin), et révéler la membrane en chambre noire avec un développeur.

La vidéo et les photos ont été prises dans notre propre laboratoire. Merci à Aurélien Pitois (anciennement technicien chez Tebubio) qui a réalisé le WB. Crédits photo/vidéo: François Tissandier (IT Manager chez Tebubio).

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